Svetleči liposomi kot nadomestilo za poskuse na živalih

Botulinski nevrotoksin je eden najmočnejših poznanih strupov. Proizvaja ga bakterija Clostridium botulinum. Toksin inhibira prenos signala iz živčnih končičev do mišic, kar vodi v paralizo in onemogočeno dihanje. Le en mikrogram na kilogram telesne teže je odmerek, ki lahko ubije odraslega človeka.  Botulinski nevrotoksin je razvpit zastrupljevalec živil, ki se lahko na primer pojavlja v nezadostno steriliziranih pločevinkah z zelenjavo.

Botulinski toksin pa ima tudi svoje prednosti. Z njim zdravijo številne kronične bolezni in poškodbe, med drugim živčno pogojene neuravnanosti na telesu kot sta tortikolis in strabizem, migreno ali teniški komolec. Od 90ih let naprej omenjen toksin s pridom uporabljajo tudi v kozmetični industriji pod imenom Botox, ki služi za glajenje obraznih gubic.

Vendar pa je uporaba botulinskega toksina igra z ognjem. Toksin je naravni proizvod in ga ni mogoče proizvajati v konstantnih koncentracijah. Zaradi te lastnosti zahtevajo organi za odobritev uporabe, da se vsaka serija terapevtikov, ki vsebujejo botulinski toksin, pregleda in se ji določi toksičnost s testom za LD50 na miškah. S tem testom se določa pri katerem odmerku umre polovica poskusnih živali. Za takšne rutinske laboratorijske preiskave v farmacevtski industriji vsako leto v Evropi in ZDA pogine več kot pol milijona miši.

Intenzivnejše svetlikanje pomeni višje koncentracije

Nov testni sistem, ki ga je razvil strokovnjak Oliver Weingart v sodelovanju s švicarskim Laboratorijem Spiez, bi lahko sedaj rešil te poskusne živali. Omenjen sistem testiranja je prvi, ki deluje brez uporabe živih živali ali celičnih kultur. Aktivnost živčnega strupa namreč določa s pomočjo umetno izdelanih mešičkov iz lipidne membrane, tako imenovanih liposomov. Tako je raziskovalec v laboratoriju za mikrobiologijo živil izumil drobcene mešičke, obdane z dvojno lipidno membrano, ki so podobni celicam živčnim končičev. 

V membrane so vgrajeni specifični receptorji, na katere se veže botulinski toksin po principu ključa in ključavnice. Zaradi kislosti okolne tekočine se struktura toksina spremeni tako, da se njegov del lahko infiltrira v liposom. V njegovi notranjosti razvije dodatno aktivnost, s katero razgradi poseben protein v notranjosti mešička. Ta po svojem razpadu prične fluorescirati. Jakost fluorescence je linearno odvisna on donkcentracije botulinskega toksina – Bolj kot se liposomi svetlikajo, višja je koncentracija strupa v testiranem terapevtiku.

Ceneje, enostavno in natančneje

Metoda ima očitne prednosti: „Proizvodnja liposomov je poceni, za delo z njimi pa ne potrebujemo posebej šolanega osebja,“ pravi Weingart. Ob tem je meja detekcije botulinskega toksina pri miših okoli 10 pikogramov. Cilj nove metode je, da bi se s pomočjo liposomov lahko dokazovalo tudi količine strupa, manjše od pikograma, torej bilijonino grama.

Merljiva fluorescenca je pri novem postopku dosežena že po eni do treh urah testiranja. Dokončen rezultat je na voljo že po manj kot 24 urah, pri miših pa je potrebno čakati vsaj en do tri dni. „Ugotovili smo, da je ideja izvedljiva,“ pojasnjuje Martin Loessner, profesor za mikrobiologijo živil. Raziskovalci so tako pričeli s standardizacijo testnih rezultatov. Ob tem je potrebno optimizirati tudi liposome, da bodo podajali natančnejše rezultate meritev.

Zaščitena s patentom

V raziskovalnem delu so sodelovali strokovnjaki Medicinske visoke šole v Hannovru, podjetje Miprolab GmbH iz Göttingena ter Laboratorij Spiez, kjer je Weingart pričel s svojim projektom. Sedaj so skupaj patentirali svoj testni sistem ter ga tako zaščitili po vsem svetu. Weingartu v nadaljnjem delu pomaga pridobljena štipendija, pridobljena s strani „3R Research Foundation Switzerland“. Omenjena organizacija se zavzema za izboljšave na področju testiranja na živih živalih po principu 3R (Reduction, Refinement and Replacement), pri čemer jo podpirajo organizacije za zaščito živali in farmacevtska industrija.

Do sedaj so se znanstveniki ukvarjali predvsem s področjem farmacevtske industrije. Martin Loessner in Oliver Weingart pa si prizadevata tudi, da bi se testni sistem lahko prenesel na druga področja. Možnost obstaja, da se podobne testne metode za iskanje nevrotoksinov, razvijejo tudi za pregledovanje pitne vode ali živil.